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Dissertações de Mestrado Defendidas: 2009

Produção de Vírus Adeno-Associados por Transfecção de Células HEK293 cultivadas em Suspensão

Autora: Érica Alessandra Schulze
Orientadores: Ricardo de Andrade Medronho, Leda dos Reis Castilho

Resumo

Vírus adeno-associados recombinantes (rAAVs) têm mostrado resultados promissores em testes clínicos para a terapia gênica. No entanto, o rAAV é tradicionalmente produzido em células dependentes de ancoragem, cultivadas em frascos estáticos ou garrafas rotatórias, e a ultracentrifugação é utilizada para a sua purificação. Estas práticas são adequadas apenas para operação em escala laboratorial, sendo necessário desenvolver abordagens diferentes para operação em maior escala, devendo apresentar baixo custo e robustez operacional.

Cada sorotipo do AAV apresenta uma composição capsidial diferente, tem um único tropismo tecidual e, portanto, uma eficiência de transdução seletiva para entregar os genes aos tecidos-alvo. Assim, há uma demanda de produção de diferentes sorotipos de AAV.

Neste trabalho, foi investigada a produção de rAAVs, através da transfecção de células HEK293 em suspensão, em meio de cultivo livre de soro, com três diferentes plasmídeos. Avaliou-se a produção de diferentes sorotipos recombinantes de AAV (2.5 e 2/6), quantificando-se de suas partículas virais infecciosas (IVP) e genômicas (Vg). Polietilenoimina foi utilizada como transportador de DNA.

Comparou-se a produção de vetores de rAAV com DNA de fita simples ou autocomplementar.

Foram também avaliadas diferentes densidades celulares, concentrações de plasmídeos, tempos de colheita das partículas virais, métodos para a lise celular e para a purificação dos AAVs. A produção de rAAV2.5 e rAAV2/6 em frascos agitados utilizando DNA de fita simples ou auto-complementar, sendo a transfecção conduzida a 1x106 células/mL e 1 µg de DNA plasmidial/mL de cultura celular, após 48 horas de transfecção, resultou em títulos superiores a 4x108 IVP/mL e 3x1010 Vg/mL, e 1x108 IVP/mL e 8x1010 Vg/mL, respectivamente. O tempo de colheita das células foi avaliado apenas na produção de rAAV2.5, tendo-se obtido maiores produtividades quando as células foram coletadas 48 horas após a transfecção. Os métodos de lise celular testado (ciclos de congelamento/descongelamento e adição de Triton® X-100) mostraram que as concentrações de IVP e Vg obtidas foram semelhantes em ambos. Para o aumento de escala, os rAAVs foram produzidos em biorreatores com 2 litros de volume útil.

Utilizando-se DNA de fita simples, com transfecção a 1x106 células/mL e 1 µg de DNA plasmidial/mL de cultura celular, os valores encontrados após 48 horas de transfecção foram superiores a 5x108 IVP/mL e 2x1010 Vg/mL para o rAAV2.5 e superiores a 2x108 IVP/mL e 7x1010 Vg/mL para o rAAV2/6.






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